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口蹄疫O型抗體檢測試劑盒（酶聯免疫法）
使用說明書
【產品名稱】
通用名：口蹄疫O型抗體檢測試劑盒（酶聯免疫法）
英文名：Test Kit for Antibodies to Foot and Mouth Disease Virus Asia O（ELISA）
【包裝規格】 96T×1/盒、96T×2/盒、96T×5/盒
【預期用途】 口蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus，FMDV）引起的偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，其特征為口腔黏膜、蹄部、乳房皮膚發生水泡和爛斑。
本試劑用于檢測牛、羊、豬血清中口蹄疫O型抗體，可用于口蹄疫O型疫苗免疫效果評價。
【原 理】
本試劑盒由預包被口蹄疫O型抗體的酶標板、抗體工作液、抗原液、酶標記物及其他配套試劑組成，應用阻斷酶聯免疫法（ELISA）原理檢測牛、羊、豬血清樣本中口蹄疫O型抗體。實驗時將稀釋的樣本與抗原液同時加入酶標板中孵育，樣本中的抗體與酶標板上的抗體競爭抗原，阻斷抗原與板的結合；經洗滌后，再加抗體工作液孵育；經洗滌后加入酶標記物孵育；再經洗滌除去未結合的酶標記物，在孔中加底物液，與酶標結合物反應形成藍色產物，顯色深淺與樣品中的特異性抗體含量成負相關；加入終止液終止反應后，產物變為黃色；用酶標儀在450nm波長測定各反應孔中的吸光值，即可知樣品是否含有口蹄疫O型抗體。
【試劑盒組成】
序號 | 名稱 | 規格/96T×1 | 規格/96T×2 | 規格/96T×5 |
1 | 酶標記物 | 6ml×1(紅蓋) | 11ml×1(紅蓋) | 26ml×1(紅蓋) |
2 | 抗體工作液 | 6ml×1(藍蓋) | 11ml×1(藍蓋) | 26ml×1(藍蓋) |
3 | 抗原液 | 6ml×1(黑蓋) | 11ml×1(黑蓋) | 26ml×1(黑蓋) |
4 | 20X濃縮洗滌液 | 40ml×1(白蓋) | 40ml×2(白蓋) | 200ml×1(透明) |
5 | 底物液A | 6ml×1(白蓋) | 11ml×1(白蓋) | 26ml×1(白蓋) |
6 | 底物液B | 6ml×1(黑蓋) | 11ml×1(棕蓋) | 26ml×1(黑蓋) |
7 | 終止液 | 6ml×1(黃蓋) | 11ml×1(黃蓋) | 26ml×1(黃蓋) |
8 | 陽性對照 | 1.0 ml×1(紅蓋) | 1.5 ml×1(紅蓋) | 2.0 ml×1(紅蓋) |
9 | 陰性對照 | 1.0 ml×1(綠蓋) | 1.5 ml×1(綠蓋) | 2.0 ml×1(綠蓋) |
10 | 酶標板 | 96T×1 | 96T×2 | 96T×5 |
11 | 蓋板膜 | 1 | 2 | 5 |
12 | 自封袋 | 1 | 1 | 2 |
13 | 說明書 | 1 | 1 | 1 |
14 | 稀釋板 | 1 | 2 | 5 |
【儲存及有效期】 2～8℃保存，有效期12個月。
包被板開封后請于2～8℃避光保存，避免受潮。使用期限為2個月。
【適用儀器】 含450nm、630nm波長的酶標儀，37℃恒溫設備，可調微量移液器。
【樣品準備】
1.取動物全血按常規方法制備血清，要求血清清亮，無溶血、無污染。樣品1周內可于2～8℃保存，長期需置-20℃保存。
2.用工作洗滌液將待檢牛、羊血清先按32倍稀釋（如5μl血清加入155μl工作洗滌液中，混勻），待檢豬血清按16倍稀釋（如5μl血清加入75μl洗滌液中，混勻），陰、陽性對照不用稀釋。
3.濃縮洗滌液使用前應恢復至室溫使沉淀溶解，然后用蒸餾水或去離子水作20倍稀釋成工作洗滌液(如19份蒸餾水或去離子水+1份濃縮洗滌液)。
【檢驗方法】
1.使用前將試劑盒置室溫30分鐘，恢復至室溫。
2.取所需用量酶標板條，設陰性/陽性對照各2孔，未用的板條盡快密封，2～8℃保存。
3.陰、陽性對照孔分別加入陰、陽性對照50μl，樣品孔每孔先加入工作洗滌液25μl，再加入稀釋后的樣品25μl；最后都加入抗原液50μl。
注：加入抗原后牛、羊樣本稀釋比例相當于1:128，豬樣本稀釋比例相當于1:64。
4.震蕩混勻10秒，蓋好蓋板膜，置37℃（推薦水浴）避光反應30分鐘。
5.甩去孔內液體，每孔加350μl工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復洗滌5次，最后一次拍干。
6.每孔加抗體工作液50μl，蓋好蓋板膜，置37℃避光反應30分鐘。
7.洗滌，同步驟5。
8.每孔加酶標記物50μl，蓋好蓋板膜，置37℃避光反應30分鐘。
9.洗滌，同步驟5。
10.每孔依次加底物液A、底物液B各50μl，混勻，蓋好蓋板膜，置37℃避光反應15分鐘
11.每孔加終止液50μl，混勻，于450nm(可用630nm作參比波長）測定各孔吸光值（A值）。
【參考值】 實驗正常的情況下，陰性對照A值≥0.8，陽性對照A值≤50%×陰性對照A值。
【檢驗結果的解釋】
1.PI（阻斷率）=（1- 陰性對照平均A值）×100%，PI≥50%為陽性；PI＜50%為陰性。
2.本實驗檢測牛、羊血清結果為陽性時表明待檢樣本中含有口蹄疫O型抗體，且效價高于1:128，達到保護水平；反之檢測結果為陰性時表明待檢樣本中不含有口蹄疫O型抗體，或效價低于1:128，未達到充足保護水平。
3.本實驗檢測豬血清結果為陽性時表明待檢樣本中含有口蹄疫O型抗體，且效價高于1:64，達到保護水平；反之檢測結果為陰性時表明待檢樣本中不含有口蹄疫O型抗體，或效價低于1:64，未達到充足保護水平。
4.如需了解樣本抗體的最終效價，可將樣本進行梯度稀釋，使PI≥50%的最高稀釋比例即為該樣本抗體的最終效價。
【試驗方法的局限性】
該試驗僅作為定性牛、羊、豬血清中口蹄疫O型抗體，根據PI值高低可作抗體水平強、中、弱的粗略評估。
該試劑盒不適用于合成肽疫苗免疫抗體效價評估。
【注意事項】
1.實驗操作時需戴手套、穿工作衣，嚴格健全和執行消毒隔離制度，各種實驗廢棄物都應按傳染物處理。
2.終止液具有腐蝕性，應避免接觸皮膚和衣物，如不慎接觸請立即用大量自來水沖洗。
3.酶標板從冷藏環境中取出時應恢復至室溫方可開袋，未用完的酶標板需放入有干燥劑的密封袋中保存。
4.濃縮洗滌液在低溫時容易結晶，使用時需恢復至室溫溶解。
5.洗滌時各孔均需加滿液體，防止孔口有游離酶不能洗凈。
6.用于檢測的樣品應保持新鮮。
7.試驗結果的判定必須以酶標儀讀數為準。
8.不同批號試劑組分不得混用。
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