PCR三個(gè)基本反應(yīng)步驟

標(biāo)準(zhǔn)的PCR三個(gè)基本反應(yīng)步驟：

第一步，DNA變性（90℃-96℃）

雙鏈DNA在高溫作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

第二步，退火（60℃-65℃）

溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

第三步，延伸（70℃-75℃）

在Taq酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′到3′端的方向延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。

每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。

PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加 熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增

形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引 物的退火(復(fù)性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后

，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；引物的延伸DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，

以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性--

退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需 2～4分鐘，

2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。P

CR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué) PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用Y=(1+X)n計(jì)算。

Y代表DNA 段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，

 但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA 段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，

被擴(kuò)增的DNA 段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn) 入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)"，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶

PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的競爭等因素。大多數(shù)情況下，平臺(tái)期的到來是不可避免的。